M. Renou

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RENOU Michel

Olfaction de l’insecte

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Recherche

La communication chimique : une fonction-clé chez les insectes.

L’olfaction est une modalité sensorielle particulièrement importante chez les insectes car elle permet la reconnaissance à distance de ressources vitales comme un site de ponte, un hôte ou un partenaire sexuel, puis leur localisation. Neurobiologiste de formation, je me suis intéressé très tôt à la physiologie sensorielle et au comportement animal avec pour motivation de comprendre comment un organisme appréhende son environnement et déploie les réponses comportementales adaptées. Au cours de ma formation doctorale dans l’équipe de Charles Descoins, confronté à un environnement multidisciplinaire associant chimistes, physico-chimistes, et biologistes, j’ai été sensibilisé à la nature spécifique du signal odorant et aux méthodes permettant de l’isoler. Par la suite, une formation post-doctorale dans le laboratoire du Professeur Schneider, au Max Planck Institut für Verhaltensphysiologie de Seewiesen, m’a permis de développer mes compétences en neurobiologie de l’olfaction.

Une biologie appliquée à l’identification de phéromones.

Durant les premières années qui suivirent mon recrutement à l’INRA j’ai participé à l’identification de phéromones et à la caractérisation de leur activité biologique par des approches sensorielles (criblage de molécules par électroantennographie) et comportementales (mise au point de mélanges attractifs par olfactométrie). J’ai ainsi contribué à l’identification de phéromones chez 24 espèces de lépidoptères nocturnes et de coléoptères phytophages. Des applications en biocontrôle dans les filières fruitières ou horticoles ont été développées grâce à la conception d’attractifs sexuels. Désirant valoriser ce savoir-faire en abordant d’autres contextes de communication, j’ai étudié le rôle de signaux chimiques dans les relations hôtes-parasites chez des Hyménoptères parasitoïdes utilisés en lutte biologique. En collaboration avec Nicole Hawlitzky, nous avons pu montrer l’importance de signaux cuticulaires pour la reconnaissance de l’hôte chez les Trichogrammes (Renou et al 1989) ou une mouche tachinaire (Rahal et al, 1996).

 

Communication chimique et phylogénie.

Les connaissances acquises sur la composition chimique des phéromones d’une diversité d’espèces m’ont amené à réfléchir sur leur valeur chimio-taxonomique et sur leur évolution chez les lépidoptères. J’ai ainsi étudié des espèces d’intérêt écologique ou phylogénétique (Zygènes et Ecailles par exemple) par une approche originale permettant le criblage d’un grand nombre d’espèces, avec un petit nombre d’individus capturés au sein d’un même milieu (piégeage lumineux couplé à l’électrophysiologie). Grâce à des analyses multifactorielles combinant données expérimentales (Renou, Lalanne-Cassou et al 1986, 1988) et données de la littérature, ces travaux ont révélé un conservatisme des structures chimiques au sein des groupes taxonomiques (familles et sous familles de Noctuelles ; Renou, Lalanne-Cassou, Michelot et al 1988), signe d’une forte composante phylogénétique pour expliquer la nature chimique des phéromones , une absence apparente d’influence du milieu physique, et des variations structurales autour d’un même squelette moléculaire assurant la spécificité de la communication entre espèces sympatriques.

Cartouches SSR
Cartouches de stimulation SSR. Photo M.Renou

Organisation fonctionnelle des organes de l’olfaction.

La spécificité de la communication phéromonale est directement liée à la détection du signal phéromonal par des récepteurs spécialisés. Avant l’avènement des approches moléculaires l’étude de relations structure-activité ne pouvait se faire que grâce à la caractérisation fonctionnelle des neurones récepteurs olfactifs (NROs) par électrophysiologie. J’ai monté un poste dédié à l’enregistrement de l’activité des NROs au niveau d’unités morpho-fonctionnelles de l’olfaction, les sensilles, portées par les antennes de l’insecte. J’ai alors étudié les mécanismes de reconnaissance des constituants phéromonaux, première étape du codage sensoriel aboutissant à la discrimination du bouquet phéromonal. La phéromone sexuelle est un bouquet de quelques constituants détectés par des NROs spécialistes selon un codage de type « labelled line ». En associant morphologie (microscopie électronique à balayage) et électrophysiologie j’ai pu mettre en évidence des plans d’organisation à l’échelle de l’espèce et  comparables avec ceux entre espèces apparentées chez les Noctuelles (Renou, Lucas et al 1991).  De plus, la présence de NROs spécialisés dans la détection d’inhibiteur interspécifique (un composé présent dans le mélange phéromonal d’une espèce sympatrique et qui inhibe l’attraction) est fréquente. Le constituant majoritaire est celui pour lequel il existe le plus de NRO spécifiques (Lucas et Renou, 1989, 1991, Renou et Lucas, 1994). L’association de l’anatomie (microscopie électronique à balayage pour définir les types de sensilles, et microscopie électronique à transmission pour décrire leur ultrastructure) à l’électrophysiologie, m’a été très utile pour étudier les adaptations particulières au mode de vie des organes olfactifs chez d’autres ordres d’insectes. Chez la punaise Nezara viridula, le développement post-embryonnaire est de type hétérométabole. Contrairement aux papillons, les larves et les adultes des punaises ont un même mode d’alimentation et la morphologie générale de leurs antennes est très semblable. Cependant leurs antennes sont fonctionnellement différentes, seuls les adultes perçoivent la phéromone sexuelle. Patrick Brézot (Thèse sous ma direction, soutenue en 1994) a suivi l’évolution de la sensibilité et le développement du système olfactif au cours du développement post-embryonnaire et mis en évidence un développement de type allométrique des antennes, certains types de sensilles augmentant plus vite en nombre d’un stade à l’autre (Brézot et al 1996). Chez les coléoptères du genre Oryctes les antennes en lamelle portent des sensilles en placodes, dont la cuticule très contournée et les dendrites très ramifiées assurent une grande surface d’échange avec l’atmosphère, compensant la faible surface disponible en raison de la compacité de l’antenne (Renou et al 1998). Une bonne connaissance de l’organisation périphérique de l’olfaction incluant des données quantitatives est indispensable pour interpréter les différences d’activité électroantennographique entre odorants et les mécanismes de leur codage au niveau central, ou pour la caractérisation fonctionnelle et la dé-orphanisation des récepteurs olfactifs (ORs).

 

Physiologie de l’olfaction.

Au cours de ces études il m’est apparu indispensable de mieux connaitre les facteurs susceptibles d’affecter la sensibilité olfactive chez les espèces que nous étudions. J’ai ainsi abordé dès 1988 des aspects physiologiques de l’olfaction sur le modèle Noctuelle pour lequel nous avions le plus de connaissances. Dans le contexte de l’unité de phytopharmacie, où les mécanismes de la résistance aux insecticides neurotoxiques étaient étudiés, il était naturel de s’intéresser aux effets des insecticides sur l’olfaction, les neurones récepteurs olfactifs apparaissant particulièrement exposés aux xénobiotiques de par leur fonction de chimiorécepteurs devant lier des molécules exogènes. J’ai initié des travaux originaux en écotoxicologie visant à étudier comment des insecticides pouvaient affecter la sensibilité des NROs (thèse de Philippe Lucas, 1990). Nous avons montré que les insecticides pyréthrinoïdes provoquent des « bursts » d’activité, perturbant la transmission du signal vers le lobe antennaire (Lucas et Renou, 1992). Par la suite, nous nous sommes intéressés aux régulations endogènes de l’olfaction et la gustation en collaboration avec Frédéric Marion-Poll. Nous avons mis en évidence une modulation de la sensibilité olfactive par les amines biogènes (thèse de Xavier Gromaitre, 2001). L’octopamine modifie le potentiel de sensille et augmente l’intensité de la réponse et l’activité spontanée des NROs (Grosmaitre et al, 2001). Un récepteur à l’octopamine est exprimé dans les antennes. L’activité locomotrice déclenchée par une stimulation phéromonale est amplifiée en présence d’octopamine. Ces travaux ont souligné le besoin d’ études mécanistiques du fonctionnement du système olfactif périphérique et pour cela d’un investissement fort dans de nouvelles approches et en nouvelles compétences. Cette nouvelle thématique a fait l’objet du projet de recherche proposé à Philippe Lucas qui à la suite de son recrutement à l’INRA en 1990 a introduit dans l’équipe des approches d’électrophysiologie moléculaire (patch clamp), puis développé avec succès des recherches mécanistiques sur la transduction olfactive à partir d’un système original de neurones olfactifs en culture (Pézier et al, 2007). Parallèlement aux progrès significatifs dans la compréhension de mécanismes de la transduction apportés par P. Lucas, Emmanuelle Jacquin-Joly développait dans notre Unité la génomique fonctionnelle de l’olfaction. Dans ce nouveau contexte, je me suis intéressé à l’imagerie fonctionnelle que je pensais pouvoir mettre au service de la caractérisation fonctionnelle de récepteurs olfactifs et utiliser pour mes projets en complément des approches électrophysiologiques in vivo. J’ai donc monté un poste d’imagerie calcique (Fura 2) et ai pu enregistrer des signaux calciques in-vitro. Cependant, en raison des difficultés à stimuler in vitro avec des molécules très hydrophobes, d’autres stratégies comme l’expression hétérologue dans le système Drosophile se sont avérées plus efficaces. Cette expérience en imagerie m’a cependant été utile dans mes projets ultérieurs où l’imagerie in-vivo, développée par Nina Deisig, nous a permis de tracer des cartes d’activation glomérulaire dans le lobe antennaire en réponse à des mélanges d’odeurs.

Perturber l’olfaction à l’aide d’analogues.

Désireux de maintenir un lien fort entre recherche cognitive et contexte agronomique, je me suis interrogé sur les potentialités de lutte contre les insectes ravageurs par perturbation de leur système olfactif. Une collaboration avec le laboratoire d’Angel Guerrero au CSIC de Barcelone a permis d’étudier le mode d’action d’analogues structuraux, ce laboratoire ayant réussi la synthèse de dérivés fluorés de phéromone. Ces dérivés inhibent in vitro les estérases antennaires responsables du catabolisme des molécules odorantes (ODEs) mais leurs modes d’action in vivo n’étaient pas connus. Ces molécules me semblaient intéressantes à étudier par les approches électrophysiologiques que je maitrisais, à la fois en tant qu’outils pharmacologiques, le rôle des ODEs n’étant pas complètement établi, et pour en évaluer les potentialités pratiques. Nous avons ainsi mis en évidence des effets antagonistes, réversibles, sur la réponse à la phéromone (Renou, Berthier, Guerrero, 2002 ; Quero et al 2004) et corrélés à des effets comportementaux (d’abord en tunnel de vol, Quero et al 1996, puis grâce à un actographe développé spécialement : Renou, Berthier et al 1999). Les dérivés fluorés de phéromone ne sont également révélés de bons outils pour aborder les relations structure-activité au travers de la modélisation moléculaire (Hayase et al, 2005, 2009 ; Itoh et al, 1998, 1999, 2004). En ce qui concerne leur utilisation agronomique, il reste cependant un questionnement sur leurs impacts environnementaux, bien que des tests d’ingestion orale sur souris n’aient pas mis en évidence de toxicité sur Vertébrés. De plus, leurs effets étant réversibles à court terme, il semble difficile de garantir un taux de protection efficace et durable. Contrairement à la relative simplicité d’utilisation d’un attractif au sein d’un piège, ou de répulsifs dont l’application peut être focalisée sur la cible à protéger, la protection de surfaces cultivées par masquage olfactif à l’aide d’antagonistes me semble plus complexe à réaliser avec les molécules actuellement disponibles.

Multimodalitarité de la communication.

L’olfaction, modalité sensorielle dominante pour la communication sexuelle chez les papillons nocturnes, est particulièrement efficace en termes de distance d’action, de faible coût de production du signal et de faible exposition à la prédation. Mais la communication est aussi souvent multi-modalitaire. Bien que les mâles de la punaise verte, Nezara viridula, émettent une phéromone sexuelle, mâles et femelles produisent des vibrations pour communiquer sur une même plante. J’ai initié une collaboration avec le laboratoire d’Andrej Čokl à Ljubljana pour étudier conjointement ces modalités. Nadège Miklas (Thèse à l’Université Paris XIII soutenue en 2002) a montré que la perception de vibrations femelles stimule la production de phéromone chez le mâle (Miklas et al, 2003). Cette phéromone déclenche en retour une attraction chez les femelles. Chez cette punaise la communication sexuelle ne peut se décrire comme une succession stéréotypée de phases au cours desquelles chaque modalité jouerait un rôle indépendant mais l’insecte intègre des informations issues de ces modalités complémentaires. Cet exemple souligne l’importance d’approches éthologiques, la caractérisation d’un signal odorant dans un contexte simplifié ne suffisant pas à comprendre sa fonction précise pour l’utiliser ensuite en protection des cultures.

Punaise verte
La Punaise verte, Nezara viridula, communique par des vibrations et des phéromones

Importance de l’arrière-plan odorant.

Ces réflexions m’ont convaincu d’étudier la communication à un niveau plus intégratif dans les écosystèmes tout en me recentrant sur les interactions entre odeurs contextuelles et signal. Les insectes évoluent dans un environnement olfactif complexe et changeant, constitué d’une très grande diversité de composés organiques volatils émis par les végétaux terrestres. Quelques travaux ayant mis en évidence des interactions inattendues entre phéromone sexuelle et odeurs de plante-hôte, sans que les mécanismes en soient clairement identifiés, j’ai choisi de développer les études de la perception d’un signal olfactif au sein d’un environnement odorant. Les phéromones sont perçues dans un environnement olfactif composé des émissions volatiles des communautés végétales au sein desquelles les insectes évoluent. Ces émissions volatiles peuvent être des signaux écologiquement significatifs (par exemple des odeurs florales permettant la localisation d’une source de nectar dont beaucoup de papillons se nourrissent) mais dans leur globalité elles constituent un arrière-plan odorant (beaucoup de molécules n’ont pas de signification écologique mais peuvent créer un « bruit » olfactif altérant la perception de molécules-signal). Outre son intérêt écologique propre, le système phéromone/odeurs de plantes est un très bon modèle pour étudier comment un système sensoriel peut extraire un signal au sein d’un environnement complexe et changeant.

Interactions odeurs de plante et codage phéromonal.

Au cours de ces dernières années nous avons montrer que des composés volatils de plante (VPC) affectent le codage des signaux phéromonaux. Différentes modalités d’interactions ont été mises en évidence, et varient selon l’espèce et selon le composé. Le linalool est un antagoniste de la phéromone chez Spodoptera littoralis (Thèse de Virginie Party, 2011 ; Party et al 2009). En revanche, l’heptanal, un constituant majoritaire de l’arôme des fleurs de tilleul, excite les neurones phéromonaux chez Agrotis ipsilon (Rouyar et al 2015). Une analyse de l’activité des neurones dans différentes ambiances olfactives a permis de caractériser quantitativement les effets d’un bruit olfactif sur le codage intensitif, quantitatif et la cinétique de la réponse (Renou et al 2015). Les dynamiques de présentation des VPC et de la phéromone sont déterminantes et la présence de VPC modifie également la dynamique de la réponse des NROs (cinétique de réponse et codage des stimuli intermittents – Thèse d’Angéla Rouyar, 2013, Rouyar et al 2011). Grâce à la collaboration avec Sylvia Anton pour les enregistrements unitaires et de Nina Deisig pour l’imagerie calcique, les réponses à la phéromone en présence de VPC des neurones des lobes antennaires (premier centre d’intégration des signaux olfactifs) ont été analysées, permettant de décrire les effets de l’arrière-plan olfactif sur le codage olfactif dans le cerveau (Deisig et al 2014, Rouyar et al 2015, Dupuy et al, en préparation).

Tracks 2D
Trajectoires de papillons enregistrées sur le compensateur de locomotion

Ces recherches ont été précédées d’efforts importants pour se doter de nouvelles techniques ou instruments. Pour suivre le comportement d’orientation des papillons répondant à la phéromone dans des environnements olfactifs complexes nous avons tout d’abord utilisé un compensateur de locomotion. Ce dispositif permet d’enregistrer en continu les déplacements d’un papillon pendant que l’on fait varier son environnement olfactif. V. Party a montré qu’un papillon stimulé par la phéromone réagit à des changements de son environnement odorant mettant ainsi en évidence une plasticité comportementale (Party et al, 2013). Cependant, ce compensateur ne pouvant enregistrer que la marche, j’ai souhaité le compléter par un matériel d’analyse constitué d’un tunnel de vol équipé d’un dispositif pour l’enregistrement des trajectoires de vol en 3D (logiciel Trackit 2.0, de SciTracks). J’ai développé dans le langage R des outils d’analyse des trajectoires (script 3D-Track) qui permettent de mesurer les paramètres des vols et d’analyser en détail les déplacements dans le tunnel. J’ai également développé un stimulateur olfactif 16 voies, basé sur des modules DAQ USB National Instrument programmés par une interface développée sous LabVIEW. Les concentrations des odeurs à la sortie du stimulateur et leur distribution dans le tunnel de vol peuvent être mesurées en temps réel grâce à un détecteur à photoionisation (PID). Pour ces différentes applications, j’ai écrit un exécutable doté d’une interface simple qui facilite l’utilisation au sein du laboratoire par des expérimentateurs ne possédant pas la maîtrise du langage ayant été employé pour leur développement.

stimulateur
Stimulateur olfactif programmable

Communication et paysage olfactif.

Si les expériences en laboratoire ont validé notre hypothèse de la modulation du signal par l’arrière-plan odorant nous sommes loin de comprendre ce qui se passe dans des agrosystèmes complexes. Les émissions volatiles des plantes forment des paysages olfactifs (odorscapes) susceptibles de subir de profondes modifications en réponse au changement climatique global. Les capacités des insectes à s’adapter à l’évolution de leurs odorscapes sont très mal connues. J’ai poursuivi mes efforts pour replacer mes travaux dans des contextes écologiques et systémiques en recherchant des collaborations avec des spécialistes de la production de VPCs au travers du montage d’un projet ANR qui a été sélectionné en 2015. Le projet ODORSCAPE, financé sur 4 ans, a réuni des physiologistes et éco-physiologistes de la plante avec des physiologistes de l’olfaction chez l’insecte. Ses objectifs étaient de mesurer les effets de facteurs de changement climatique sur les émissions de composés volatils par des mini-écosystèmes végétaux (volatolome) et d’en analyser les répercussions sur la communication olfactive de papillons. Matthieu Dacher, s’est associé à ce projet pour développer l’étude de la plasticité et l’adaptation des comportements en fonction de l’expérience olfactive et des changements de contexte. Nous avons montré un déplacement de la composition du bouquet phéromonal optimal pour l’attraction des mâles et une modification des profils de réponse des neurones du lobe antennaire codant le bouquet phéromonal en présence d’heptanal (Collaboration Sylvia Anton, Hoffmann et al 2020). Mieux connaitre les mécanismes d’extraction de l’information olfactive pour pouvoir les perturber permet certes de viser des objectifs opérationnels en biocontrôle. Mais la spécificité de la communication sexuelle est assurée par la proportion des constituants phéromonaux et une altération de la perception de ce bouquet, aura des conséquences sur la reconnaissance du partenaire sexuel et l’accouplement assortatif. Les travaux sur les espèces présentes dans les agrosystèmes contribuent ainsi à mieux connaitre la sensibilité aux modifications de leurs paysages sensoriels des insectes en général, un enjeu en biologie de la conservation.

Chemical communication: a key function in insects.

Olfaction is particularly important in insects because it allows the remote recognition of vital resources such as an egg-laying site, a host or a sexual partner, and their location. A neurobiologist by training, I became interested very early on in sensory physiology and animal behavior with the motivation to understand how an organism apprehends its environment and deploys adapted behavioral responses. During my doctoral training in Charles Descoins’ team, faced with a multidisciplinary environment associating chemists, physico-chemists, and biologists, I was made aware of the specific nature of the odorous signal and of the methods used to isolate it. Subsequently, post-doctoral training in the laboratory of Professor Schneider, at the Max Planck Institut für Verhaltensphysiologie in Seewiesen, enabled me to develop my skills in the neurobiology of olfaction.